Cystická fibróza a genetika

Cystická fibróza (CF) sa označuje ako genetické ochorenie. Aby pacient mal cystickú fibrózu musí nevyhnutne mať prítomnú mutáciu v CFTR géne (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator). Presnejšie, musí mať mutácie v oboch alelách génu tak, že jednu mutáciu zdedí od jedného rodiča a druhú od druhého (mutácie majú ancestrálny pôvod). CF je autozomálne recesívne ochorenie. To znamená, že prítomnosť mutácie iba v jednej alele nespôsobí ochorenie. Jedinec s mutáciou v jednej alele sa označuje ako heterozygot, alebo archaicky tiež ako “nosič“, t.j. môže preniesť ochorenie na svoje potomstvo. Napríklad v prípade, že má dieťa s iným heterozygotom (nosičom). Bolo objavených mnoho druhov mutácii CFTR génu, pričom druh mutácie má vplyv na závažnosť a priebeh ochorenia – jednotlivé mutácie majú rôzne klinické dôsledky.

Z Mendelových zákonov dedičnosti vyplýva že:

• Heterozygot (nosič) a homozygot bez CFTR mutácií, budú mať vždy zdravé potomstvo (nebude mať CF)
• Pri potomstve dvoch heterozygotov (s jednou mutáciou CFTR) je pravdepodobnosť, že každý ich potomok bude mať CF 25 %
• Ak by mal homozygot s dvomi CFTR mutáciami (pacient s CF) potomstvo s homozygotom bez CFTR mutácií, všetci ich potomkovia budú zdraví (nebudú mať CF)
• Ak by mal homozygot s dvomi CFTR mutáciami (pacient s CF) potomstvo s heterozygotom, je pravdepodobnosť 50 % pre každého ich potomka, že bude mať CF
• Ak by mali potomstvo dvaja homozygoti s dvomi CFTR mutáciami (pacienti s CF) bude s pravdepodobnosťou 100 % tiež mať CF

Molekulárna genetika a štruktúra CFTR proteínu

Gén spôsobujúci CF bol objavený v roku 1989. Jeho poloha bola určená na úseku 7q31.3, na siedmom chromozóme. Pomenovaný bol CFTR, pričom niekedy sa v genetických databázach používajú aj synonymné názvy ABCC7, ABC35 (resp. aj niektoré ďalšie). Gén je zložený z 27 exónov, jeho dĺžka je približne 250kb. Produktom génu je CFTR proteín.

CFTR je membránový proteín, ktorý patrí do skupiny “ATP-binding cassette“ transmembránových transportných proteínov (ABC transportérov). Jeho funkciou je medzimembránový transport chloridových iónov v epitelových bunkách. CFTR sa skladá z 1480 aminokyselín, je usporiadaný do piatich proteínových domén, pričom dve domény sú transmembránové (TM1, TM2) a ďalšie dve sa označujú ako nukleotid viažúce (NBD1, NBD2). Pre otvorenie iónového kanálu je potrebná fosforylácia regulačnej (R) domény Proteín kinázou A (PKA). Proteín kináza A vyvolá fosforyláciu naviazaním ATP, čo vedie k konformačným zmenám CFTR proteínu. CFTR proteín je exprimovaný v tkanivách, ktoré sú typicky postihnuté pri CF: v pľúcach, pankrease, potných žľazách, pohlavných orgánoch. Zaujímavé je, že CFTR je exprimovaný aj v obličkách, ale pri CF sa to klinicky neprejavuje.

Genetické vyšetrenie

Cieľom genetického vyšetrenia je zistiť analýzou DNA, či má daný jedinec hľadané genetické znaky – v prípade CF určiť, či má mutácie v géne pre CFTR a o ktoré konkrétne mutácie sa jedná. Na genetickú analýzu je potrebný informovaný súhlas pacienta, resp. zákonného zástupcu. Za účelom vyšetrenia sa odoberie malé množstvo krvi, prípadne je tiež možné získať vzorku výplachom ústnej dutiny. Tiež je možné prenatálne vyšetrenie plodu u tehotnej ženy amniocentézou (od. 15. týždňa), alebo choriovou biopsiou (od 13. týždňa). Technika analýzy je založená na polymerázovej reťazovej reakcii (PCR) a rutinne sa vyšetrujú najčastejšie mutácie. Napr. 36 najčastejších mutácií v ČR populácii predstavuje 96 % všetkých prípadov CF. Z toho vyplýva, že bežné genetické diagnostické techniky nezachytia všetky CFTR mutácie. V skutočnosti napríklad pri kite obsahujúcom 38 celosvetovo najčastejších mutácií je záchyt v ČR populácii okolo 90 % mutácií, keďže niektoré mutácie sú špecifické pre českú populáciu a tie nie sú obsiahnuté v diagnostickom kite. Z toho sa dá odvodiť približne 10 %-ná pravdepodobnosť falošne negatívneho výsledku (pre každú mutáciu). Na druhej strane v prípade pozitívneho výsledku (zistenia mutácie v CFTR géne) je výsledok spoľahlivý s pravdepodobnosťou takmer 100 %. Ak nie je určená mutácia a napriek tomu sa dá predpokladať, že daná osoba ju má, napríklad v prípade, že ju genetický test založený na PCR nezachytil a jedná sa o pacienta s klinickými prejavmi CF, je možné prítomnosť mutácie dokázať sekvenovaním DNA. Bežne sú tak objavené zriedkavé mutácie, ktoré sú niekedy popísané vôbec prvý krát. Samozrejme potenciálnym problémom môže byť falošne negatívny výsledok najmä v prípadoch, keď sa prítomnosť CFTR mutácie skôr neočakáva a preto nie je dôvod na vyšetrenie sekvenovaním. Ceny rutinných genetických vyšetrení sa v poslednom období výrazne znížili, aj keď napríklad pri sekvenovaní ako technicky náročnejšej metóde, nie sú nízke.

Genetické vyšetrenie je žiadúce vo viacerých prípadoch – spravidla sa používa na  potvrdenie diagnózy po pozitívnom potnom teste, resp. pozorovaní klinických prejavov u CF pacienta. Genetické vyšetrenie sa odporúča v prípade výskytu CF aj u príbuzných pacienta. Napríklad zdravý súrodenec CF pacienta má pravdepodobnosť 50 %, že zdedil mutáciu v CFTR géne a má teda výrazne vyššie riziko, že jeho potomkovia budú mať CF, v prípade že aj jeho partner by bol heterozygotom s CFTR mutáciou. Analýza DNA predstavuje obrovský pokrok v diagnostike, je však potrebné pamätať aj na niektoré jej obmedzenia.

Populačná genetika

Mutácie CFTR génu sú v ľudskej populácii rozšírené dosť nerovnomerne. Zatiaľ čo CF je najčastejším závažným genetickým ochorením u ľudí európskeho pôvodu, je omnoho zriedkavejšie pri čiernej a ázijskej rase. V Európe je nosičom génu približne každý 25-ty človek, u američanov hispánskeho pôvodu je pomer nosičov 1:45, u černochov 1:65 a 1:90 u ázijcov. V rámci Európy je najvyšší výskyt mutácii v CFTR géne v Írsku a smerom na juh klesá. Slovensko a Česká republika sú blízko európskeho priemeru s pomerom približne 1:25. Bolo popísaných viac ako 1800 mutácii CFTR génu, pričom takmer vo všetkých populáciách je najčastejšia mutácia F508del. Zoznam mutácií nájdete v Ensembl browseri alebo v Cystic Fibrosis Mutation Database. Zastúpenie jednotlivých mutácií je v jednotlivých ľudských populáciách rozdielne. Mnohé sú špecifické pre konkrétne populácie ako napríklad mutácia G551D pre západnú Európu, W1282X u etnických židov, G542X v stredomorí. Pri niektorých ďalších mutáciách bol ale preukázaný nezávislý pôvod a vyskytujú sa v nepríbuzných populáciách, ako napr. R553X, R117H, R334W.  V Slovenskej populácii, podobne ako vo väčšine Európy dominuje mutácia F508del. Jej zastúpenie je však relatívne nižšie – okolo 55 %. Oproti ČR je nižšie zastúpenie typicky slovanských mutácii CFTRdele2,3, 2143delT a vyššie je zastúpená stredomorská mutácia G542X.

Z genetického výskumu vyplýva, že jediným spôsobom ako sa mohli mutácie CFTR tak rozšíriť v populácii je, že poskytujú (alebo v minulosti poskytovali) určitú evolučnú výhodu pre prežitie jedincov s jednou mutáciou CFTR génu – heterozygotov. Podobný efekt bol opísaný aj pri niektorých ďalších genetických ochoreniach (najznámejšie pri kosáčikovitej anémii, kde sú heterozygoti odolnejší proti malárii), pričom častou heterozygotnou výhodou v týchto známych prípadoch je zvýšená odolnosť voči niektorým infekčným ochoreniam. Bolo zistené, že baktérie cholery (Vibrio cholerae) a brušného týfusu (Salmonella typhi) využívajú pri infikovaní buniek CFTR proteín, čo viedlo k predpokladom, že heterozygoti s CFTR mutáciou by mohli mať zvýšenú odolnosť voči týmto ochoreniam. Tieto predpoklady neboli zatiaľ vedecky potvrdené, naopak objavilo sa viacero teórii o iných zdrojoch CFTR heterozygotnej výhody a táto téma je stále otvorená.

Klinická genetika, modifikujúce gény, liečba, génová terapia

V rámci CF pacientskej populácie sú značné rozdiely v závažnosti a priebehu ochorenia, pričom podstatný vplyv na túto variabilitu majú genetické faktory – niektoré CFTR mutácie sú klinicky závažnejšie, resp. sú známe aj mutácie CFTR génu, ktoré nevedú k prejavom CF. Mutácie boli najprv rozdeľované ako “závažné“ (príznaky pankreatickej insuficiencie, ochorenia pečene, diabetes) a “mierne“ (bez poškodenia pankreasu, atypické formy CF, CBAVD). Z patofyziologického hľadiska je dôležité, či je pri danej mutácii čiastočne (reziduálne) zachovaná funkčnosť CFTR. Aj pacienti ktorí majú iba jednu miernu mutáciu majú priaznivejší klinický stav. Z popísaných mutácií patrí k miernym (s reziduálnou funkciou) iba asi 10 %. Niektoré (zriedkavé) mutácie CFTR génu nevedú ku klinickým prejavom CF, sú známe ako jedna z možných príčin mužskej neplodnosti (CBAVD – Congenital Bilateral Absence of the Vas Deferens). Mužská neplodnosť sa prejavuje prakticky vždy aj pri závažných mutáciách. Neskôr bola navrhnutá klasifikácia mutácii do tried, podľa toho aký je ich patofyziologický mechanizmus.

Ďalší genetický výskum ukázal, že ani genetická variabilita CFTR (spolu s enviromentálnymi faktormi) úplne nevysvetľuje fenotypickú variabilitu a bol vyslovený predpoklad tzv. CF modifikujúcich génov. Niekoľko takýchto génov bolo identifikovaných asociačnými genetickými štúdiami a niektoré ďalšie môžu mať význam, ale ich vplyv zatiaľ nebol jednoznačne potvrdený. Jedným z génov, ktorý má vplyv na priebeh CF je MBL2 (Mannose Binding Lectin). MBL2 ovplyvňuje imunitné procesy a má vplyv na to ako úspešne dokáže organizmus čeliť bakteriálnym a vírusovým infekciám, ktoré sú najčastejšou komplikáciou CF. Znížená funkcia MBL2 vedie k horšej prognóze CF.  Ďalším známym génom je EDNRA (Endothelial receptor type A), ktorý ovplyvňuje činnosť hladkých svalov dýchacích ciest. Gén TGF-β1 (Transforming Growth Factor β1) má význam pri astme a COPD tým, že reguluje zápal a remoduláciu dýchacích ciest. Viacero štúdii potvrdilo, že má význam aj pri CF. Gén T2DM by mohol mať vplyv na riziko pre rozvoj diabetu pri CF (CFRD), alebo MSRA (Methionine Sulfoxide Reductase A) pre riziko mekóniového ileu. Tieto (a niektoré ďalšie) vzťahy sú predmetom prebiehajúceho výskumu.

Moderné lieky na CF – Kalydeco, Orkambi, Symdeko účinkujú na úrovni CFTR proteínu a prinášajú kauzálnu liečbu, označujú sa aj ako CFTR modulátory. Stále však nie sú dostatočne účinné na to, aby dokázali úplne odstrániť symptómy CF, iba ich zmierňujú tým, že čiastočne zvyšujú funkčnosť defektného CFTR. Tieto lieky sú indikované na základe prítomnosti konkrétnej mutácie v CFTR géne. Kalydeco je určené pre pacientov s mutáciami G551D, G1244E, G1349D, G178R, G551S, S1251N, S549N, S549R, R117H a Orkambi u pacientov s dvomi mutáciami F508del. Symdeko je určené pre pacientov s dvomi mutáciami F508del (rovnako ako Orkambi, najmä v prípade,že sa u daného pacienta pri Orkambi vyskytnú nežiadúce účinky) a tiež pre pacientov s jednou mutáciou F508del a ďalšou, ktorá je responzívna na kombináciu tezacaftoru a ivacaftoru. K týmto liekom má v Európe v súčasnosti kvôli ich vysokej cene prístup iba malá časť pacientov.

Génová terapia je medicínsky koncept, ktorý predpokladá náhradu nefunkčného génu, v prípade CF nahradenie mutovaného CFTR funkčným génom v organizme pacienta. Predpokladá sa, že  nahradenie 5-10 % mutovaných CFTR génov v pľúcach pacienta vedie k odstráneniu pľúcnych klinických prejavov CF. Najoptimistickejší pohľad bol na génovú terapiu okolo roku 2000, keď sa predpokladalo, že po zosekvenovaní ľudského genómu (Human Genome Project)  bude možné relatívne jednoducho liečiť genetické defekty. Tejto oblasti sa následne začalo venovať množstvo laboratórnych štúdii. Rýchlo však začalo byť jasné, že dopravenie a integrácia funkčného génu do organizmu pacienta bude problematická. Prvá (2b) klinickcká štúdia génovej terapie pri CF prebiehala až v roku 2012 a jej výsledkom bolo iba veľmi mierne zlepšenie klinických parametrov. V súčasnosti génová terapia už nepatrí medzi hlavné oblasti výskumu liečby CF a nepredpokladá sa, že by v blízkej dobe zabezpečila spoľahlivú liečbu. Určitý rozruch a novú nádej priniesol výskum génovej technológie CRISPR/Cas9 po roku 2010. Štúdia z roku 2013 preukázala, že v laboratórnych podmienkach je možné využiť CRIPSR/Cas9 aj na opravu CFTR génu a v tejto oblasti prebieha ďalší výskum. Z pohľadu klinického  aj genetického výskumu majú pri CF význam tiež zvieracie modely ochorenia. Za účelom štúdia CF boli vytvorené modely CF u myši, prasaťa a fretky – CFTR gén bol integrovaný do genómu týchto druhov pokusných zvierat.